3. Přímý průkaz a typizace původců infekce


   

Obr. 3.1 Světelná mikroskopie (A) a mikroskopie s fázovým kontrastem (B) (mezofilní bakterie z pitné vody)



Obr. 3.2 Schematické znázornění bakterií, které jsou nejčastěji prokazované v klinickém materiálu: grampozitivní koky (A), gramnegativní tyčinky (B) a přímý průkaz bakterií lokalizovaných intracelulárně v neutrofilech (stafylokoky ve sputu pacienta s cystickou fibrózou) (C).



   

Obr. 3.3 Původce můžeme prokázat přímo pomocí fluorescenční mikroskopie, kdy specifické protilátky jsou označené fluorochromem, který emituje fluorescenci. Negativní kontrola (A) – buňky tkáňové kultury po inkubaci s protilátkami značenými fluorochromem, pozitivní vzorek (B) – infikovaná tkáňová kultura po inkubaci se specifickými protilátkami značenými fluorochromem.



Obr. 3.4 Elektronová mikroskopie je vhodná pro průkaz virů. Na základě struktury, symetrie a velikosti mohou být zařazeny alespoň do skupin (A, dva viriony viru Epsteina a Barrové s viditelnými obaly
(reference: http://biestmilch-seven.com/archives/2009/08/18/chronic-epstein-barr-virus-infection-in-athletes-or-dare-to-take-a-break.html).
Elektronová mikroskopie se u bakterií používá pouze pro experimentální účely, např. pro studium povrchových struktur (B, Listeria monocytogenes, původem z hemokultury febrilního pacienta).



Obr. 3.5 Schéma reakce PCR. Specifický úsek DNA se denaturuje při teplotě přibližně 95 °C (A), specifické primery se navážou na komplementární úseky templátové DNA při teplotě přibližně 55 °C (B) a nové vlákno DNA je syntetizováno podle předlohy přibližně při teplotě 72 °C (C). Počet cyklů PCR se pohybuje většinou od 30 do 40 cyklů.



Obr. 3.6 Průkaz pozitivního výsledku reakce PCR: Negativně nabité fragmenty DNA (amplikony) migrují agarózou v závislosti na své velikosti k anodě. Po obarvení fluorescenčním barvivem a ozáření UV jsou viditelné jako proužky. Amplikon genu gltA s velikostí 379 bp (2) a jeho profil (1) specifický pro Bartonella henselae po štěpení restriktázou (71, 137, 171 bp).



Obr. 3.7 Komplementární sonda DNA značená enzymem (A) se naváže na cílovou DNA (např. na membráně) (B). Stabilita komplexu sondy s DNA se prověří opakovaným promytím. Ke komplexu se přidá substrát (C), který reaguje s enzymem sondy za vzniku barevné reakce (D). Analýza 20 vzorků na pevném nosiči (pozitivní vzorky – tmavé) (E).



Obr. 3.8 Zpracovaný vzorek přidáme na pevný nosič (1). Antigen (Ag) ze vzorku se naváže na specifické protilátky (Ab) značené např. latexem za vzniku komplexu antigen-protilátka (Ag-Ab1) (2). V linii 3 se komplex Ag-Ab naváže na další protilátku (Ab2) specifickou k Ag a dojde tudíž k pozitivní reakci, která se projeví barevnou reakcí. Přebytek protilátky Ab1 difunduje dál po pevném nosiči (4) a vytvoří barevnou linii s další specifickou protilátkou (Ab3) (5), což slouží jako kontrola, že test byl správně proveden.